自2015年10月首个溶瘤病毒疗法被FDA批准用于治疗黑色素瘤后[1]，越来越多的临床研究证明，溶瘤病毒在癌症治疗中确具有一定作用，如在胶质母细胞瘤[2]及软组织肉瘤中[3]。
除了溶瘤病毒自身复制导致被感染的肿瘤细胞死亡之外，细胞死亡后的裂解产物还可吸引大量CD8+T细胞，从而诱导肿瘤特异性T细胞反应来杀伤肿瘤细胞[4]。
(资料图)
然而，研究人员发现，溶瘤病毒疗法会使肿瘤中PD-L1表达上调，从而削弱了抗肿瘤免疫反应[5]。因此，开发新的策略来最大限度地发挥溶瘤病毒疗法的潜力，一直是领域研究的热点。
近日，来自厦门大学的夏宁邵教授团队，成功构建了重组表达抗人源PD-1单链可变片段（hPD-1scFv）的溶瘤单纯疱疹病毒载体（YST-OVH），YST-OVH可明显增强小鼠肿瘤中CD8+T细胞的活性，在多种人源化PD-1小鼠肿瘤模型中均有明显抗肿瘤效果。
非人灵长类动物中的神经毒性和安全性评价显示，YST-OVH没有明显神经毒性，在非人灵长类动物中耐受性良好，具有非常好的临床转化潜力，相关研究成果发表在著名期刊《癌症免疫治疗杂志》[6]。
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目前，溶瘤病毒疗法的效果受到两大因素的限制，一个因素是溶瘤病毒的扩散能力有限、对组织的穿透性不佳，另一个因素即是肿瘤微环境中的免疫抑制因子，它们导致免疫细胞处于失活状态，削弱了溶瘤病毒的抗肿瘤效果。
针对第一个因素，科学家利用具有肿瘤趋向性，且具有良好扩散及组织穿透能力的神经干细胞作为溶瘤病毒的载体，在动物模型及1期临床研究中取得良好效果，一定程度上解决了这个问题[7]。
而针对第二个因素，科学家们也尝试了多种方式来解决这一问题。
首先想到的解决办法，便是将溶瘤病毒疗法与免疫检查点抑制剂疗法相结合，且这一组合疗法在黑色素瘤、结肠癌中已被证实确实能够起到不错的效果，甚至对一些原本对免疫检查点抑制剂疗法不敏感的患者，也具有良好的疗效[8, 9]。
紧接着，科学家们自然而然地想到，可否直接让溶瘤病毒表达可激活免疫反应的蛋白，如细胞因子和免疫检查点特异性的抗体等，这在技术上是完全可行的。
“说干咱就干”。经改造后的可表达IL-7、IL-12[10]及抗PD-1（厦门大学夏宁邵教授团队[5]）、抗TIGIT（南京大学魏继武教授团队[11]）的溶瘤病毒相继问世。
厦门大学夏宁邵教授团队在其前期设计的重组表达抗鼠源PD-1单链可变片段（mPD-1scFv）的溶瘤单纯疱疹病毒载体（OVH-aMPD-1）的基础上（人和小鼠PD-1的氨基酸同源性约为61%），设计了首个抗人源PD-1单链可变片段（hPD-1scFv）的溶瘤单纯疱疹病毒载体（YST-OVH）。
感染YST-OVH的细胞可表达和分泌hPD-1scFv，与肿瘤微环境中淋巴细胞上的PD-1相结合，起到改善免疫应答的作用。本次研究中，夏宁邵教授团队在动物模型中对YST-OVH的抗肿瘤活性进行了验证，同时还报道了在非人灵长类动物中的可行性和安全性结果。
研究人员首先在体外检测了hPD-1scFv蛋白在YST-OVH感染细胞上清液中的表达，结果显示hPD-1scFv蛋白在感染后72小时达到高峰，且YST-OVH在细胞内的复制能力与亲本病毒（OVH）相似。
hPD-1scFv蛋白在感染细胞后72小时达到高峰（细胞上清液中）
紧接着，研究人员检测了YST-OVH在体内及体外对肿瘤细胞的杀伤作用。
在体外实验中，YST-OVH和OVH对多种人类癌细胞和正常细胞的杀伤作用相似，且对肿瘤细胞的杀伤作用与病毒的感染剂量呈正比。
YST-OVH和OVH对多种人类癌细胞和正常细胞的杀伤作用相似，且对肿瘤细胞的杀伤作用与病毒的感染剂量呈正比
在体内实验中，研究人员在人肝癌细胞系（Hep3B）和人肺癌细胞系（A549）皮下移植小鼠（在这些小鼠中，YST-OVH产生的hPD-1scFv并不起作用）中评估YST-OVH的作用。结果显示，YST-OVH和OVH对肿瘤的抑制效果也类似。
在人肿瘤细胞皮下移植小鼠中，YST-OVH和OVH对肿瘤的抑制效果类似
为了评估YST-OVH中hPD-1scFv的作用，研究人员构建了表达人源PD-1的肝癌小鼠模型，并用其评估YST-OVH的治疗作用（肿瘤移植4天后开始，小鼠接受四次静脉注射病毒治疗）。结果显示，接受YST-OVH治疗的小鼠肿瘤（基本消失）显著小于OVH治疗组，生存期也更长，所有接受YST-OVH治疗的小鼠在86天的观察期内均存活下来，且肿瘤没有复发。
这表明YST-OVH中的hPD-1scFv起到效果。
接受YST-OVH治疗的小鼠肿瘤（基本消失）显著小于OVH治疗组，生存期也更长
对YST-OVH治疗的小鼠肿瘤组织进行质谱流式细胞术（CyTOF）检测发现，肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润及活性均增加，CD8+T细胞耗竭减少。这与YST-OVH设计的初衷相一致。
此外，研究人员发现，YST-OVH治疗后的肿瘤组织中耗竭的CD8+T细胞上高表达CTLA-4和TIM-3这两个免疫抑制分子。同时，YST-OVH治疗对CTLA-4+Treg细胞（免疫抑制作用）比例无显著影响。这些结果提示，YST-OVH与适当的免疫检查点阻断治疗联合（如抗CTLA-4或抗TIM-3治疗），可逆转T细胞耗竭和阻断激活的Treg细胞，起到促进抗肿瘤免疫应答的效果。
YST-OVH治疗后的肿瘤组织中不同T细胞变化
结果也不出所料，YST-OVH和抗CTLA-4的联合治疗比两者单用的效果要更好。对小鼠肿瘤组织的RNA-seq测序结果显示，几种免疫相关信号通路，如获得性免疫反应、T细胞激活、淋巴细胞激活等，在联合治疗的肿瘤中显著富集。
YST-OVH和抗CTLA-4的联合治疗比两者单用的效果要更好
最后，研究人员还在非人灵长类动物（恒河猴）中检测了YST-OVH疗法的神经毒性和安全性。最终的结果表明，YST-OVH对恒河猴无明显神经毒性，且耐受性良好。
总的来说，本研究构建了首个抗人源PD-1单链可变片段的溶瘤单纯疱疹病毒载体，且临床前研究显示，相比于单纯溶瘤病毒治疗，YST-OVH对肿瘤的抑制效果更好，且在非人灵长类动物中的良好安全性，使得该疗法具有十分强的临床转化潜力，期待该疗法的1期临床试验结果。
参考文献
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